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(相关资料图)

CpG密度（CpG density）与各种组织中的DNA甲基化相关。基因组按CpG密度分为：CpG岛（CpG island，CGI）、CpG岛上下游2kb以内的区域（CpG shore ，CpG岛岸）、CpG岛岸上下游2kb以内的区域（CpG shelve，CpG大陆架），一共5个区域，分别统计各区域的甲基化水平。

全基因组DNA甲基化分析是用于基因组表征和差异DNA甲基化分析的最常见表观遗传学过程之一。先前的全基因组分析表明，CpG密度是DNA甲基化方法中的一个重要变量。目前的研究旨在分析各种不同物种基因组中的CpG密度，并将其与各种DNA甲基化分析数据集进行关联分析。对人、大鼠、鸟类、鱼类的基因组中观察到类似的结果：90%以上的基因组区域属于低密度类别（1-3 CpG/100bp），小于10%的基因组区域属于高密度类别（>5 CpG/100bp）。甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）使用抗5-甲基胞嘧啶抗体免疫沉淀，然后进行下一代测序（MeDIP-Seq），MeDIP偏好<5 CpG/100bp的低CpG密度（对应>95%的基因组）。减少代表性重亚硫酸盐测序（RRBS）通常在≥3CpG/100bp的较高CpG密度区域中鉴定DMR（对应约20%的基因组）。全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）在通常大于10 CpG/100bp更高的CpG密度区域分析，且WGBS可鉴定≥2 CpG/100bp区域（约占基因组50%）。CpG密度是DNA甲基化分析中的关键变量，不同分子技术专注于不同的基因组区域，本文比较了MeDIP-Seq、RRBS、WGBS三种DNA甲基化分析方法。

比较方法

MeDIP-seq、RRBS、WGBS每种技术均从目标细胞类型或组织的DNA提取和纯化开始。

MeDIP-seq将DNA超声处理成几百个碱基对的短片段，产生单链DNA以实现有效的抗体结合，然后使用5-甲基胞嘧啶抗体结合包含甲基化CpG位点的片段。这些片段通常用结合抗体的磁珠分离，并用PCR扩增DNA后测序。PCR包括通用引物和索引引物以及条形码引物，以扩增所有DNA片段。MeDIP-seq的局限在于无法达到单碱基分辨率，不是高通量测序，不能鉴定单个CpG甲基化水平和高密度的CpG位点。

基于亚硫酸盐转化的RRBS和WGBS是可以达到单碱基分辨率的高通量DNA甲基化测序方法。

RRBS使用甲基化敏感的限制性内切酶消化，在高GC密度CpG位点将未甲基化的DNA酶切成片段。对这些片段进一步处理并选择大小并靶向启动子和CpG岛区域，所得片段进行亚硫酸盐转化，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，同时保留未转化的甲基化胞嘧啶，随后对片段进行PCR扩增并测序。

WGBS对全基因组进行亚硫酸盐处理和分析，在亚硫酸盐转化之前不进行甲基化片段分离。对亚硫酸盐转化后的全基因组甲基化进行测序，并使用各种生物信息学方案，通常用于基因组表征。

比较结果

在人、大鼠、鱼（斑马鱼和钢头鳟鱼）和鸟类（鸡）基因组中研究了全基因组CpG密度分布。从NCBI或Ensembl获得参考基因组序列，初步分析1000bp窗口鉴定全基因组CpG密度。基因组主要由<3 CpG/100bp的CpG密度较低区域组成，小部分基因组位点的CpG密度较高。在所有不同物种的基因组中观察到类似结果。在<3 CpG/100 bp的基因组区域中，对应于97%的人基因组、98%的大鼠基因组、88%的斑马鱼基因组、93%的钢头鳟鱼基因组、94%的鸡基因组。基因组中很少有1kb区域>20CpG/100bp（人1，鸡8，其他0），存在一些>10CpG/100bp的CpG密度较高区域（即CpG岛）（约占基因组1%），但绝大多数密度<5CpG/100bp。在大鼠基因组中，48%的100bp基因组窗口没有CpG，但当使用1kb窗口时，基因组下降到5%。结果表明基因组主要为低CpG密度，在用于研究全基因组DNA甲基化的方法中需要考虑到这一点。

图1：全基因组CpG密度。对应于CpG/100 bp的全基因组1 kb区域数。

（a）人、（b）大鼠、（c）钢头鳟鱼、（d）斑马鱼、（e）鸡

MeDIP-seq分析

此前研究已证明MeDIP分析偏好基因组低密度CpG区域。在NCBI GEO下载每个物种基因组发布的可用MeDIP-Seq数据集，以鉴定获得数据的CpG密度分布。图2为不同物种MeDIP-seq数据的代表性实例，分析重点在于两个不同样品组比较以鉴定用于数据分析的差异DNA甲基化区域（DMR）。MeDIP-seq数据集的DMR CpG密度分析结果表明大部分DMR为0–3 CpG/100bp的CpG密度，主要密度为1 CpG/100 bp，这与代表性基因组中的主要密度相关。在不同物种样本之间观察到一些变化，斑马鱼DMR尤其显示出向稍高的1-4 CpG/100 bp的CpG密度转变，可能归因为精子和红细胞两种不同细胞类型。总之结果表明MeDIP-seq数据能有效分析低密度基因组CpG区域（<3 CpG/100 bp），其占不同物种的基因组90%以上。

图2：甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-Seq）

差异DNA甲基化区（DMRs）的百分比对应于每100bp的CpG位点数量。

（a）人类MeDIP研究1 DMR；（b）人类MeDIP研究2 DMR；（c）大鼠MeDIP研究1 DMR；（d）大鼠MeDIP研究1 DMR；（e）斑马鱼MeDIP研究1 DMR；（f）斑马鱼MeDIP研究1 DMR；（g）斑马鱼MeDIP研究2 DMR；（h）钢头鳟MeDIP研究1 DMR；（i）钢头鳟MeDIP研究1 DMR；（j）鸡MeDIP研究1 DMR；（k）鸡MeDIP研究2 DMR；（l）鸡MeDIP研究2 DMR。

RRBS分析

在几种不同物种中比较了用于DNA甲基化分析的RRBS方法，确定每个数据集的CpG/100bp密度（图3）。数据集分析结果表明在DMR CpG密度分布中显示出分裂：一些数据集显示在＞10 CpG/100 bp 的RRBS DMR中，CpG密度向更高方向变化，而其他数据集则显示向中等CpG密度变化。图2（a-c）和图3（c）中>10 CpG/100 bp的 CpG密度主要为10-12 CpG/100 bp，但如果增加到1 kb，则>10 CpG中约2/3低于10 CpG/1 kb。除鱼类之外，只观察到1或2 CpG/100 bp密度可忽略检测。结果表明，与MeDIP分析相比，RRBS数据偏向更高密度的CpG区域（如≥3CpG/100bp）。有趣的是，钢头鳟鱼的数据集在两个不同实验室的相同样品上分别使用了MeDIP-Seq和RRBS方法（图2和图3），因此对相同样品的不同分析进一步证明了MeDIP对较低密度CpG的偏倚和RRBS对较高密度CpG的偏倚。

图3：不同物种的减少代表性亚硫酸盐测序（RRBS）

差异DNA甲基化区域（DMR）的百分比对应于每100bp的CpG位点数量

（a） 人类RRBS研究1 DMR；（b）人类RRBS研究1 DMR；（c）大鼠RRBS研究1 DMR；（d）大鼠RRBS研究1 DMR；（e）斑马鱼RRBS研究1 DMR；（f）斑马鱼RRBS研究1 DMR；（g）斑马鱼RRBS研究2 DMR；（h）斑马鱼RRBS研究2 DMR；（i）钢头鳟鱼RRBS研究1 DMR；（j）钢头鳟鱼RRBS研究1 DMR。

WGBS分析

在几个不同物种中比较了用于DNA甲基化的全基因组重亚硫酸盐（WGBS）分析方法，确定每个分析的DMR CpG/100bp密度（图4）。结果表明WGBS数据集的CpG密度与RRBS数据集CpG密度范围类似。在向更高CpG密度（2-5 CpG/100bp）发生微小变化的分析与>10 CpG/100 bp的CpG密度分析之间存在差异。除了鸡之外，1 CpG/100 bp DMR的检测最少。观察结果表明，WGBS数据靶向比MeDIP分析更高密度的CpG区域。

图4：不同物种的全基因组重亚硫酸盐（WGBS）分析

（a） 人类WGBS研究1 DMR；（b）大鼠WGBS研究1 DMR；（c）大鼠WGBS研究2 DMR；（d）斑马鱼WGBS研究1 DMR；（e）斑马鱼WGBS研究2 DMR；（f）鸡WGBS研究1 DMR。

图5：不同DNA甲基化分析方法的基因组百分比

（a） 每种方法的基因组百分比（1kb基因组窗口的百分比）与所有物种的平均值。总条形图表示MeDIP 0–5 CpG/100bp、WGBS≥2 CpG/100bp、RRBS≥3 CpG/100bp、CpG岛芯片阵列的基因组总百分比。空心条表示不同方法的reads比对限制百分比。

（b） MeDIP 0–5 CpG/100 bp、WGBS≥2 CpG/100 bp和RRBS≥3 CpG/100 bps的每种方法在不同物种的基因组百分比（插图图例）。

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参考文献：

Beck D, Ben Maamar M, Skinner MK. Genome-wide CpG density and DNA methylation analysis method (MeDIP, RRBS, and WGBS) comparisons. Epigenetics. 2022 May;17(5):518-530.

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